贵州为我国绿茶的主要省份，而凤冈产茶历史悠久。唐代茶圣陆羽在他撰写的世界第一部茶书《茶经》八之出中记述:“黔中生思州、播州、费州、夷州……，往往得之，其味极佳”。据考证，夷州治所就是今凤冈县绥阳镇。宋代《华阳国志》中“平夷产茶蜜”，乐史《太平寰宇记》“夷州、播州、思州以茶为贡”和清代《梅移随笔》“龙泉产云雾芽茶，色味双绝”中的夷州、思州、龙泉都是指今凤冈一带。最新科学研究表明，富锌富硒绿茶中所含有的天然物质成分对防衰老、防癌、抗癌、杀菌、消炎等均有特殊效果，为其他茶类所不及。笔者通过测定肝脏组织中SOD 和GSH-Px 的mRNA 及其蛋白质表达水平，研究富锌富硒绿茶对D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠的抗氧化、抗衰老作用，为贵州特色茶叶产业的发展和推广提供营养保健的基础数据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料和仪器
1. 1. 1 动物。昆明雄性小鼠70 只，体重(18 ～ 25 g)，购自贵阳医学院动物中心(合格证:10000S38)。
1. 1. 2 药物。供试富硒富锌绿茶由贵州凤冈县永安镇田坝村所产，2013 年春季采摘。经贵州省山地研究所测试中心测定，该绿茶含锌、硒含量分别是65. 47 ± 0. 02、1. 74 ± 0. 02 mg /kg。按茶水比为2 g∶20 ml 的比例，用沸水冲泡30 min 制成茶水，过滤，为高浓度组;稀释1 倍过滤后为中浓度组;再量取等体积水稀释，过滤后为低浓度组;普通绿茶泡制方法同前;维生素C 片剂，用浓度0. 9% 生理盐水配制成50 g /ml溶液。
1. 1. 3 试剂。D-半乳糖由上海恒信化学试剂厂生产;动物组织总RNA 提取试剂盒(天根，批号DP121221);Thermo 试剂盒(Fermentas 公司);6 × DNA 电泳Loading Buffer 上样液(天根，批号BC110413);溴化乙锭(EB) 溶液( 天根，批号BC120227);DNA marker(北京康为世纪生物科技有限公司生产，批号CW0632);浓度30%丙烯酰胺(赛兰博，批号8080);1. 5 mol /L Tris(pH 8. 8);1. 0 mol /L Tris(pH 6. 8);浓度10%SDS;浓度10%过硫酸胺(APS);TEMED;BAC 法蛋白定量试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司);兔抗小鼠SOD-1 多克隆抗体(Santa Cruz 公司，批号sc-11407);兔抗小鼠GSH-1 多克隆抗体(Santa Cruz 公司，批号sc-292189);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Santa Cruz 公司，批号sc-2004)。
1. 1. 4 仪器。凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad 公司)，酶标仪(美国Bio-Tek 公司)，电泳仪( 美国Bio-Rad 公司)，3k15高速冷冻离心机(德国Sigma 公司)，T148 050-900 型PCR 仪(德国Biometra 公司)，水平电泳仪( 美国伯乐BIO-RAD 公司)，Dolphin-Doc 凝胶成像系统和Dolphin-ID 软件( 美国Wealtec 公司)，高压灭菌锅(日本三洋公司)，MP200A 型电__子天平(上海良平仪器厂)，电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)，Morris 水迷宫(中国医学科学院药物所)，动物运动轨迹记录分析系统(普升科技有限公司)，HPLAS-2000 计算机图像分析系统(无憾千屏公司)。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 动物衰老模型的构建。用浓度75% 乙醇消毒小鼠下腹部，用D-半乳糖(0. 2 mg /g 小鼠体重)腹腔注射，连续14d，诱发衰老模型，之后连续28 d 每日给予相同剂量以维持衰老模型。空白组小鼠注射浓度0. 9% 生理盐水(0. 1ml /10 g小鼠体重)，给药方法同模型组。
1. 2. 2 行为学测试(游泳水迷宫试验)。在连续灌胃21 d后，采用环形水池。水池中放一低于水面1 cm 左右的逃避平台。模型小鼠预先训练4 d，每次取1、2、3、4 四个象限入水点背对站台放入水池。若小鼠在60 s 内找到平台，则使其停留15 s;若60 s 内未找到平台，则将其诱导到平台上，并停留15 s 方结束一次训练。连续训练4 d，在第5 天进行行为学测试，其检测指标有:①定向航行试验，测定每只小鼠从放入水中开始到跳到逃避平台时的时间，即逃避潜伏期;②空间探索试验，测定每只小鼠穿越平台区所用时间及穿越站台次数。
1. 2. 3 分组与给药。小鼠分为空白组、衰老模型组、普通绿茶组、富锌富硒绿茶(高、中、低剂量)组、阳性对照组(维生素C 片)，每组10 只小鼠。给药方案为:给予D-半乳糖(0. 2mg /g)14 d 后，普通绿茶组给予普通绿茶茶水灌胃;富锌富硒绿茶组按照高、中、低浓度进行灌胃;模型组、空白组给予等容积蒸馏水灌胃;阳性对照组灌胃1 g /L 维生素C 溶液，1次/d，连续给药28 d。
1. 2. 4 小鼠肝脏组织SOD、GSH-Px 蛋白质表达水平的检测。提取肝脏组织总蛋白，取少量上清液进行蛋白定量，余下- 20℃保存备用，制胶，然后取20 μl 蛋白质样品加上样缓冲液，煮沸变性后进行SDS-PAGE 电泳;电转移至PVDF 膜;用含浓度5%脱脂奶粉的TBST 振荡封闭2 h;分别加入适量一抗4 ℃封闭过夜，次日以TBS-T 洗膜3 次，每次10 min;加二抗，室温振摇孵育2 h;洗膜后ECL 法显影。以β-actin 为内参，条带经Kodok Digital Science ID Image Analysis Software 及GDS-1 数字化凝胶成像分析仪扫描，计算吸光度(A)。A 比值= 目的蛋白A/β-actinA式中，A 比值为目的蛋白表达量的相对含量。试验重复3 次，取平均值。
1. 2. 5 小鼠肝脏组织SOD、GSH-Px mRNA 表达水平的检测。用动物组织总RNA 提取试剂盒提取小鼠肝脏组织总RNA，提取后取5 μl RNA 对RNA 纯度、浓度进行检测(提取方法严格按照说明书进行)。RT-PCR 引物设计依据昆明小鼠中的SOD 和GSH-PxmRNA 序列和β-actin mRNA 序列设计，经blast 进行特异性确定。最后，由上海生物工程技术服务有限公司合成引物。SOD mRNA 上游引物:5’-CTGTACCAGTGCAGGACCTCAT-3’，下游引物:5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCTT-3’。该引物扩增的片段长度为221 bp。GSH-Px mRNA 上游引物:5’-GAAGTGCGAAGTGAATGGTGAGA-3’，下游引物:5’-AGTTGCCAGACTGCTGGGACA-3’。该引物扩增的片段长度为269bp。β-actin mRNA 上游引物: 5’-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3’，下游引物: 5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。该引物扩增的片段长度为541 bp。将提取的RNA 逆转录(RT-PCR) 成cDNA，方法参考Fermentas 公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书。然后，以cDNA 为模板，以SOD、GSH-Px 和β-actin 引物分别进行PCR 反应。PCR 反应体系为:ddH2O 6 μl，2 ×Taq PCR MasterMix 13 μl，上下引物各1 μl，上下内参各1 μl，模板2 μl。PCR 扩增反应条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环，最后72 ℃延伸5 min。产物在PCR 反应结束后电泳，结果扫描保存。1. 2. 6 统计学处理。数据采用SPSS 17. 0 系统软件进行处理。计量资料采用单因素方差分析和多重比较，P < 0. 05 差异有统计学意义。
2 结果与分析
2. 1 小鼠衰老模型验证
2. 1. 1 小鼠外观。研究表明，空白组小鼠体质量正常增加;模型组小鼠从造模第28 天开始，体重增加速度下降，部分毛发脱落、失去光泽，出现行动迟缓、精神萎靡不振等症状;富锌富硒绿茶高剂量组小鼠精神状态好于普通绿茶组;富锌富硒绿茶中剂量组小鼠精神一直良好，毛发光滑整齐，体重增长速度正常;富锌富硒绿茶低剂量组小鼠精神状态略好于高剂量组小鼠;普通绿茶组小鼠表现与空白组相似;阳性组小鼠表现与中剂量组相似。
2. 1. 2 小鼠血清验证。通过对比模型组与空白对照组，发现模型组小鼠血清中MDA 含量在0. 05 水平显著升高，而血清中SOD 活力、GSH-Px 活力、过氧化氢酶(CAT) 活力显著降低。
2. 1. 3 行为学测试结果。由表1 可知，在定向航行试验中，与空白组相比，模型小鼠所用的`逃避潜伏期较长(P < 0. 01);普通绿茶组所用的逃避时间与空白组相差不大(P > 0. 05);与普通绿茶组相比，富锌富硒绿茶组所用的逃避潜伏期较短(P < 0. 01);与阳性对照组相比，富锌富硒绿茶中剂量组所用的逃避潜伏期与之相当(P > 0. 05);与模型组相比，富锌富硒绿茶组所用的逃避潜伏期明显缩短(P < 0. 01)。在空间探索试验中，与空白组相比，模型组第1 次穿越平台区所用时间延长，穿越站台次数明显减少，差异有统计学意义( P<0. 1="" p="">0. 05); 与普通绿茶组相比，富锌富硒绿茶组第1 次穿越平台区所用时间缩短，穿越站台次数增多，差异有统计学意义(P < 0. 01);与阳性对照组相比，富锌富硒绿茶中剂量组第1 次穿越平台区所用时间和穿越站台次数与之相差不大(P > 0. 05);与模型组相比，富锌富硒绿茶组第1 次穿越平台区所用时间缩短，穿越站台次数明显增多(P < 0. 01)。
2. 2 富锌富硒绿茶对衰老模型小鼠肝脏组织SOD、GSH-Px蛋白质表达水平的影响
模型组蛋白表达低于空白组，差异有统计学意义(P < 0. 01);富锌富硒绿茶高、中、低剂量组蛋白表达高于衰老模型组，差异有统计学意义(P < 0. 01);富锌富硒绿茶高剂量组蛋白表达低于低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);富锌富硒绿茶中剂量组蛋白表达高于高、低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);富锌富硒绿茶组蛋白表达高于普通绿茶组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。
2. 3 富锌富硒绿茶对衰老模型小鼠肝脏组织SOD、GSH-PxmRNA 表达水平的影响
模型组mRNA 表达低于空白组，差异有统计学意义(P < 0. 01);高、中、低剂量组mRNA 表达高于衰老模型组，差异有统计学意义(P<0. 01);高剂量组mRNA 表达低于低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);中剂量组mRNA 表达高于高、低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);富锌富硒绿茶组mRNA 表达高于普通绿茶组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。
3 讨论
富锌富硒绿茶中含有锌和硒2 种微量元素。锌元素是生物体内重要的抗氧化酶超氧化物歧化酶的辅基;硒元素是谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分，每摩尔GSH-Px 含有4 g 硒原子。因此，富锌富硒绿茶可以为机体抗氧化物质提供丰富的原材料。
研究表明，SOD 和GSH-Px 是机体抗氧化系统中2 种重要的抗氧化酶。其中，SOD 对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，能够有效清除自由基，减轻脂质过氧化，保护细胞免受损伤。赵会杰等通过D-半乳糖所致衰老小鼠饲喂SOD 苹果，发现可显著提高小鼠血清和肝脏组织的SOD、CAT 和GSH-Px 活性，抑制脂质过氧化，降低MDA 含量。GSH-Px 则是机体内重要的分解过氧化物的含硒酶。GSH-Px 的酶活力可以作为衡量机体硒抗氧化的能力。在体内，SOD 将超氧自由基O2- 转化为H2O2，GSH-Px 进一步将H2O2转化为H2O 和O2，并且通过减少过氧化物对SOD 的损害增加SOD 的活性。SOD 和GSH-Px 两者之间明显存在着相互保护作用和协同抗氧化作用。还有研究通过测定SOD 活性，推测其改善学习记忆作用可能与其提高体内SOD活性有关，其活力间接反映机体保护细胞免受损伤的抗氧化能力。
研究中，通过皮下注射D-半乳糖，在体内代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基O2- 和H2O2，引起代谢紊乱，进而提高体内自由基水平及过氧化体内组织制造和自然衰老类似的亚急性衰老模型。同时，以此为模型，研究贵州凤冈富锌富硒绿茶对小鼠的抗氧化作用。通过观察小鼠外观、血清学试验和行为学测试结果，发现造模成功。在小鼠行为学测试中，发现富锌富硒绿茶中剂量组的抗氧化作用最佳，提高小鼠的学习能力，延缓小鼠的衰老。
该试验结果进一步表明，富锌富硒绿茶可明显提高D-半乳糖所致衰老小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px mRNA 和蛋白质表达水平。富锌富硒绿茶可通过改变SOD、GSH-Px 的mRNA和蛋白质表达，导致小鼠肝脏和血清中SOD、GSH-Px 含量增加，提高酶活力，在一定程度上增加抗氧化的能力，减慢细胞衰老的速度，达到改善衰老的作用。抗氧化生化指标与水迷宫空间记忆能力试验中定向航行和空间探索试验结果相一致。另外，研究表明，中浓度富锌富硒绿茶剂量抗氧化效果更佳，原因还有待进一步研究。总之，贵州凤冈富锌富硒绿茶具有清除自由基、抗氧化等作用，改善衰老的行为学特征，延缓衰老的进程。
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