再灌注治疗能快速打开堵塞血管、恢复冠脉血供，是治疗冠心病急性心肌梗死的重要手段，据统计我国2013 年冠状动脉经皮介入术( percutaneouscoronary intervention，PCI) 的病例数超过40 万例，位居世界第2 位。但再灌注治疗只是一种局部治疗，并不能终止冠心病的病理发展进程，加之治疗后出现的一系列心肌缺血再灌注损伤( myocardialischemia reperfusion injury，MIRI) ，严重制约了冠心病的治疗效果。有研究证实，急性心肌梗死( acutemyocardial infarction，AMI) 患者即使接受最佳的再灌注治疗，仍有10% ～ 30%出现MIRI，MIRI 被认为是导致心梗后心力衰竭发生率高达25% 及年死亡率达10% 的主要原因，因此防治MIRI 是临床亟需解决的问题。动物实验发现内皮功能障碍、脂质氧化损伤、炎症反应、钙超载及能量代谢等在MIRI的发生发展中起重要作用。
MIRI 目前临床尚缺乏有效的干预药物，中医药具有作用通路广泛、作用靶点多样的特点，在临床应用中具有独到的优势。丹蒌片是痰瘀同治的上市药物，临床用于治疗各类冠心病心绞痛，临床疗效良好，目前关于丹蒌片的实验研究大都针对心肌梗死后对心脏的保护作用，而对MIRI 后心脏保护作用的研究鲜有报道。课题组前期实验研究发现，丹蒌片能降低大鼠心肌缺血程度，增加离子转运通道相关酶活性，减少短暂心肌缺血再灌注诱导的致命性及非致命性室颤发生率、室性心动过速及室性早搏的发生频率及持续时间。在此基础上，为阐明丹蒌片对已有心肌不可逆坏死的心肌缺血再灌注治疗后的心脏保护作用，本研究观察其对大鼠心肌坏死程度及心脏射血分数的影响，并从内皮功能保护、抑制脂质过氧化及细胞凋亡方面探讨其作用机制，为扩大丹蒌片的临床应用范围提供数据支撑。
1 材料
1. 1 动物清洁级雄性健康Wistar 大鼠80 只，体重( 300 ± 20) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK( 京) 2012-0001，在中国中医科学院广安门医院动物中心适应性喂养3 d。
1. 2 药品及试剂丹蒌片( 吉林康乃尔药业有限公司，国药准字Z20050244) ; 羧甲基纤维素钠，2，3，5-氯化三苯基四氮唑( TTC) ，伊文思蓝，水合氯醛( 国药集团化学试剂有限公司，批号分别为20081023，20140507，20140228，20130201) ; 乳酸脱氢酶( LDH) 试剂盒，肌酸激酶同工酶( CK-MB) 试剂盒( 贝克曼库尔特实验系统有限公司，批号分别为AUZ1443，OSR61155) ; 大鼠内皮素( ET) 试剂盒( 北京北方生物技术研究所，批号S20083014) ; 大鼠一氧化氮( NO) ，丙二醛( MDA) 及髓过氧化物酶( MPO) 试剂盒( 南京建成生物工程研究所，批号分别为A012，A003-1，A044 ) ; Protease inhibitorcocktail( Roche 公司，批号11684817910) ; 蛋白免疫印迹法( Western blot) 抗体含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶( Caspase) -3，B 细胞淋巴瘤-2( Bcl-2) 及Bcl-2相关X 蛋白( Bax) ( CST 公司，批号分别为12768，2772， 2870) ; β-肌动蛋白( β-actin) 抗体( 中杉金桥公司，批号TA-09 ) ; DNA 断裂的原位末端标记法( TUNEL) 反应液( Roche 公司，货号11684817910) 。
1. 3 主要仪器RM6240BD 型多通道生理信号采集处理系统，HX-300 型小动物呼吸机( 成都泰萌科技有限公司) ; Pro Sound 5000 SSD-SV B 型超声仪( 日本Aloka 株式会社ALOKA 医用仪器有限公司) ; AU640 型全自动生化分析仪( 美国Olympus 公司) ; Image Pro Plus 6. 0 图像分析系统软件( 美国Media Cybernetics 公司) ; UV-2000 型紫外分光光度计( 上海尤尼柯公司) ; TGL-16 型台式高速冷冻离心机( 长沙湘仪离心机仪器有限公司) ; SPR-960 型全自动酶标仪( 美国Thermo 科技公司) ; VE186 型小型高通量垂直电泳槽VE180 及转移电泳槽( 上海天能公司) 。
2 方法
2. 1 分组及给药大鼠按体重随机分为假手术组、模型组、丹蒌片组，假手术组22 只，模型组30 只，丹蒌片组28 只，预防性给药7 d，然后进行造模手术。其中假手术及模型组均以0. 5%的羧甲基纤维素钠灌胃，根据文献丹蒌片给药剂量选择0. 9 g·kg - 1，丹蒌片研碎后溶于0. 5%羧甲基纤维素钠制成混悬液，灌胃体积为10 mL·kg - 1。
2. 2 模型建立以10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，经口腔行气管插管，连接小动物呼吸机，呼吸频率约70 次/min，潮气量7 ～ 8 mL，呼吸比1 ∶ 3，连接多通道生理信号采集系统，描记术前Ⅱ导联心电图。于左侧第3 或第3 肋间切口，钝性分离皮下组织及肌肉，打开心包膜，在左心耳下缘距肺动脉弓根部2 mm处结扎( 3 /8 圆针) ，进针深度约1 mm，宽度约2 mm，在冠脉前降支面置硅胶管连同冠脉用4 号医用缝合线一起结扎。50 min 后，剪去结扎线，连同硅胶管一同取出，进行再灌注。假手术组只在相应部位穿线不结扎。关闭胸腔，逐层缝合肌肉、皮肤，术后腹腔注射青霉素10 万单位预防感染。结扎成功标志: 结扎下方心肌颜色变灰白，同时心电图ST 段进行性抬高甚至弓背向上( 较正常至少抬高2 mm) 。复灌成功标志: 心脏颜色由灰白逐渐恢复正常，或30 min 内心电图ST 下降至少50%。造模前心率<350 次/min 者，未到规定时间死亡者及造模不成功者予以剔除。
2. 3 标本采集及指标检测
2. 3. 1 再灌注2 h 心肌酶、内皮功能检测每组取6 只大鼠，采集血清，以全自动生化分析仪检测LDH及CK-MB，以放射免疫法检测血清ET-1，紫外分光光度计检测血清NO 水平，紫外分光光度计检测心肌MDA，MPO 水平。
2. 3. 2 心肌梗死面积测定未取血大鼠于再灌注48 h 时处死，术前与取材前B 超检测心脏射血分数，从大鼠左肺静脉注射0. 5%依文思蓝约1. 5 mL，待大鼠口唇爪甲变蓝后摘取心脏，以冰盐水冲洗，擦干，置于- 20 ℃冻存20 min 后，沿结扎线以下切成等厚的4 ～ 5 片，放入1% TTC 溶液中，37 ℃ 孵育15 ～ 20 min，流水冲洗。非缺血区呈蓝色，缺血未梗死区呈砖红色，缺血区( area at risk，AAR) 为灰白区与砖红色区域之和，梗死区( area of necrosis，AN) 呈灰白色，放置于10%甲醛中室温固定24 h。然后用L2035AW Pioneer 数码照相机进行图像采集，以Version 6. 0 Media Cybernetics Image-Pro Plus 图像分析软件分别计算出梗死区、占缺血区面积的比例，缺血区占左室面积的比例。
2. 3. 3 Western blot 法检测心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 蛋白表达每组取6 只大鼠分别检测心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 蛋白表达。根据试剂说明书提取蛋白，BCA 法检测组织蛋白浓度，调整蛋白浓度，上样，根据蛋白目的分子量设定电泳条件，转膜，封闭，经一抗( 1 ∶ 1 000) ，二抗孵育，显色曝光，将显色后的图片扫描后，使用Gel Image system ver. 4. 00软件( 上海天能科技有限公司) 对图像进行灰度分析。以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值表示目的蛋白相对表达量。
2. 3. 4 TUNEL 法检测细胞凋亡每组取6 只大鼠做心脏石蜡切片，脱水，蛋白酶K 中孵育后避光条件下加稀释液，TUNEL 反应液，37 ℃放置1 h 转化converter-POD( POD) ，37 ℃ 烤箱中放置30 min，取出冲洗后加DAB，经苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯溶液透明，封片。于光学显微镜下观察，其中正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈现出深浅不一的棕褐色。每张切片于凋亡细胞分布相同区域随机选取5 个高倍视野，计算平均每个视野中的凋亡细胞数占总细胞数的百分比，即为凋亡指数。
2. 4 统计学处理
采用SPSS 17. 0 统计软件。计量资料结果以珋x ± s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0. 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 丹蒌片对再灌注2 h 心肌酶的影响与假手术比较，模型组及丹蒌片组LDH 及CK-MB 均显著升高( P < 0. 01) ; 与模型组比较，丹蒌片组LDH 及CK-MB 均明显降低( P < 0. 05) 。
3. 2 丹蒌片对再灌注2 h 内皮功能的影响与假手术比较，模型组血清ET-1 显著上升( P < 0. 01) ，NO 明显下降( P < 0. 05) ; 与模型比较，丹蒌片组ET-1 明显下降( P < 0. 05) ，而NO 明显上升( P<0. 05) 。
3. 3 丹蒌片对再灌注2 h 心肌组织氧化损伤的影响与假手术组比较，模型组MDA 及MPO 均显著升高( P < 0. 01) ; 与模型组比较，丹蒌片组MDA 及MPO 明显降低( P < 0. 05) 。
3. 4 丹蒌片对再灌注48 h 心脏射血分数及心肌梗死面积的影响与假手术组比较，模型组及丹蒌片组大鼠EF 值显著下降( P < 0. 01) ; 与模型组比较，丹蒌片组大鼠EF 值明显上升( P < 0. 05) 。假手术组无心肌梗死; 与模型组比较，丹蒌片组心梗/缺血面积比率显著下降( P < 0. 01) 。
3. 5 丹蒌片对再灌注48 h 心肌细胞凋亡指数影响与假手术比较，各组心肌凋亡指数均有显著升高( P < 0. 01) ; 与模型组比较，丹蒌片能显著降低心肌凋亡指数( P < 0. 01) 。
3. 6 丹蒌片对再灌注48 h 心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 的蛋白表达的影响与假手术比较，模型组及丹蒌片组Caspase-3 表达明显升高( P < 0. 05，P<0. 01) ; 与模型比较，丹蒌片组Caspase-3 表达显著降低( P < 0. 01) 。与假手术比较，模型组及丹蒌片组Bax 表达明显升高( P < 0. 05，P < 0. 01) ; 与模型比较，丹蒌片组Bax 表达显著降低( P < 0. 01) 。与假手术比较，模型组及丹蒌片组Bcl-2 表达显著降低4 讨论MIRI 在临床可表现为再灌注心律失常，心肌无复流现象及心肌顿抑等，此类患者预后不良，心力衰竭、心源性猝死等发生机率较高。其发生机制复杂，至今还未完全明确，综合以前研究结果认为，氧自由基损伤、炎症反应、内皮功能障碍、钙超载等在MIRI 过程中相互影响，对心肌造成巨大损害。其中内皮功能障碍是动脉粥样硬化发生发展的始动环节，更是贯穿心肌缺血及再灌注损伤的全过程。内皮损伤后其分泌功能障碍，扩血管物质NO 减少，破坏了与缩血管物质ET 间的动态平衡，一方面内皮损伤促进血管收缩心肌缺血进一步加重; 另一方面造成内皮细胞的屏障作用破坏，为中性粒细胞和单核细胞及炎性细胞物质的浸润提供了场所，间接加重炎症反应。此外MIRI 发生时，缺血区心肌神经末梢释放大量儿茶酚胺，被单胺氧化酶分解后产生大量氧自由基( OFR) ，超过机体的清除能力，引发链式脂质过氧化反应，损伤细胞膜、细胞器乃至细胞内核酸，进而导致细胞凋亡甚至坏死，OFR对组织的损伤要远远大于缺血本身造成的损伤。心肌细胞凋亡是MIRI 的最终环节，心肌缺血20 ～30 min 即可发生坏死并且具有不可再生的特性，故坏死周围的濒死心肌是临床治疗上争取的对象，阻止坏死周边心肌细胞凋亡成为治疗MIRI 的关键病理基础，文中提到的氧自由基、炎症因子、钙超载等共同对心肌细胞造成损伤导致细胞凋亡。Bax 和Bcl-2 是一对调节细胞凋亡的基因，Bax 促进细胞凋亡而Bcl-2 可抑制细胞凋亡，激活下一级Caspases酶系引起细胞的凋亡。其中Caspase-3 是细胞凋亡的主要执行者，活化后可分解细胞内的重要蛋白及底物，进而导致细胞凋亡。
本研究发现，丹蒌片在再灌注损伤发生的早期能促进MIRI 后内皮细胞NO 的释放，抑制缩血管物质的释放，修复受损的内皮分泌功能。MDA 反应体内自由基的多少，MPO 反应体内中性粒细胞的活动程度，丹蒌片能抑制心肌组织中MDA 及MPO 生成，改善自由基及炎症细胞对心肌的损伤。此外，丹蒌片在减少心肌梗死面积的同时还能有效阻止MIRI后心脏射血分数的下降趋势。有临床研究证实，低EF 值冠心病患者在冠脉旁路移植术前，应用主动脉内球囊反搏术可改善心功能后，能减少术后心梗、低心排血量等严重并发症的发生并能降低围术期病死率。另对择期PCI 的患者进行研究发现，白细胞计数，C 反应蛋白( CRP) 升高与EF 值降低有关，提示丹蒌片改善心脏EF 值可能与降低炎症反应的作用有关。本研究结果显示，丹蒌片可抑制心肌促凋亡蛋白Bax，Caspases-3 的表达，提高抑制凋亡基因蛋白Bcl-2 的表达，丹蒌片可能通过抑制细胞凋亡保护梗死区周围的心肌，从而降低心肌梗死区与缺血区比例，保护再灌注损伤的心脏。现代药理研究表明，丹蒌片成分中黄芪、丹参、葛根、川芎等诸多药物提取物均有广泛的心血管效应，采用生物信息学方法推测它们可能通过环加氧酶2，瘦素蛋白，一氧化氮合酶3 及低密度脂蛋白受体起作用，但尚缺乏相关实验验证，这些已知化学成分协同作用于心血管系统，从多途径、多靶点发挥MIRI 后对心脏的保护作用。
丹蒌片具有活血化痰、宽胸通阳之效，在临床应用中对稳定型心绞痛、支架植入术后患者及非血运重建急性冠脉综合征患者均有确切的疗效，亦有临床研究表明丹蒌片具有一定的降血脂和稳定斑块作用，加之其降血压和减慢心率的作用共同组成缓解临床症状的基础。MIRI 是一个复杂的病理过程，心肌细胞坏死及凋亡是心肌组织学损害的最终结果，该过程有大量信号通路参与，损害通路和救助通路交织成网状。本实验探索了丹蒌片治疗MIRI 机制，至于其对信号通路及其相关调控蛋白基因的影响有待于进一步研究，明确其作用机制，为丹蒌片防治MIRI 提供基础数据和实验支撑。
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