开口箭活性部位抗肿瘤细胞作用研究论文

2021-06-13 论文

　　1 材料与仪器

　　1.1 细胞株人宫颈癌细胞（Hela）、人肝癌细胞（HepG2）均由三峡大学分子生物学研究所提供。

　　1.2 药品与仪器RPMI-1640为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品；HEPES为美国Sigma公司产品；胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品；四氮唑蓝（MTT）为美国AMRESCO公司产品；环磷酰胺（CP,江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：07020121）。酶联免疫检测仪（GENIOS TECAN）；CO2培养箱（日本三洋公司）；LD4-2A离心机（北京医用离心机厂）；96孔板（美国Cornning公司）。开口箭根茎于2002-07采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Tupistra chinensis Bak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室（No.TC200207SNJ）。

　　2 方法

　　2.1 药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取，合并提取液，浓缩后经氯仿脱脂后用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得开口箭4部分皂苷。分别取开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷两个样品，用PBS配制成所需浓度，依次为312.5，625，1 250，2 500，5 000，10 000 μg/ml， 70%开口箭皂苷用PBS配制成所需浓度，依次为156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/ml，所有受试样品均用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。环磷酰胺（CP）用DMSO将其配置为500 mg/ml。

　　2.2 细胞培养 Hela和HepG2细胞用RPMI-1640培养液（另加10mmol/L HEPES、2.0 mg/mlNaHCO3、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37℃，5%CO2饱和湿度下培养。贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。

　　2.3 开口箭活性部位对Hela和HepG2细胞杀伤作用最佳实验条件的选择MTT法实验条件的初步优化，主要是对溶解药物的溶剂（水、PBS）、加药前的培养时间（6，12，24 h）、药物剂量和细胞密度进行了摸索。其中密度细胞分别取0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml,接种于96孔培养板，每孔接种100 μl，转板24 h后加不同浓度的开口箭活性部位，继续培养48 h，以MTT法测定吸光度，比较不同细胞密度的线性关系。

　　2.4 MTT比色法［6］MTT比色法按Mosmann氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为0.5×105个/ml,接种于96孔培养板，每孔接种100 μl，转板24 h后加100 μl受试药，另设阴性对照组（不加药）、空白调零组（只有PBS）和阳性对照组（环磷酰胺组），每组均设3个复孔，培养48 h，吸弃上清后加MTT（5 mg/ml）100 μl,继续培养4 h后，弃去上清液，加DMSO 100 μl,用全自动酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定吸光度（OD）值［7］，求出IC50。抑制率（%）=［阴性对照A570- 加药组A570］/ 阴性对照A570×100%。

　　2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分1×106个细胞于培养瓶，阴性对照组0.5×106个细胞每瓶，培养24 h；吸弃部分上清后加药混匀（开口箭总皂苷、30%皂苷终浓度2 500μg/ml，70%皂苷和环磷酰胺终浓度1 250 μg/ml），继续培养48 h；于5%CO2培养箱中培养48 h后，收集上清于相应标签离心管中，各加1 ml胰酶消化，加4 ml培养液于该培养瓶中，并一起吸至各相应离心管中，各瓶加入5 ml PBS洗涤，洗涤液一起吸入相应离心管中，以2 000 r/min离心5 min；吸弃上清，加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/LEDTA（Na）2的PBS混合液悬起细胞，轻轻混匀，于4℃固定30 min；弃上清，加PBS 10 ml混匀，以2 000 r/min离心5 min；用500 μl含0.1%TritonX-100 和50 μg/ml RNase的PBS悬起细胞，转置测定管中，加溴化丙锭PI 100 μl，避光染色17 min（一般15～20 min）；滤膜过滤后上机。

　　3 结果

　　开口箭活性部位对Hela和HepG2细胞杀伤作用最佳实验条件的选择为了得到相对稳定并且可靠的实验结果，通过前期预实验并结合大量资料，对该MTT法实验条件进行了初步优化，主要是对溶解药物的溶剂、加药前的培养时间、药物剂量和细胞密度进行了探索。对于溶剂，最初采用的溶剂是水，通过对照发现溶解药物的水对细胞的影响很小，但并非没有，所以正式实验采用PBS溶解药物；对于加药前的培养时间采用了6，12，24 h 3个时间，通过显微镜观察发现加药前培养24 h细胞状态良好，由此选用了加药前培养24 h；

　　对于药物剂量，通过多次预实验，最终选择了最高浓度开口箭总皂苷、30%皂苷为10 000 μg/ml，70%皂苷为5 000 μg/ml，而环磷酰胺为20 000 μg/ml；对于细胞密度，通过多次预实验，采用5种细胞密度即0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml，同样的'药物浓度情况下，开口箭活性部位对Hela细胞生长抑制呈最好线性关系的细胞密度是0.5×105 个/ ml，由此选择最佳细胞浓度是0.5×105个/ml。通过这些因素的优化，从而初步排除了其他非药物因素对细胞的影响；而且这两种肿瘤细胞的MTT实验在同一批进行实验，排除了不同环境的干扰，从而得出实验结果。

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