补骨脂平喘作用分析的论文

2021-06-10 论文

  1材料与仪器

  1.1动物

  SD大鼠,70只,SPF级,雌雄各半,180g左右,合格证号:0012625,由广州中医药大学实验动物中心提供。

  1.2试剂

  卵白蛋白批号:970612上海化学试剂公司;氢氧化铝干粉批号:20020301-2广州化学试剂厂;灭活百日咳杆菌(100亿个/ml)广东省中医院提供;大鼠IL-4(批号20060620)、IFN-γ(批号20060620)ELISA试剂盒由晶美生物工程有限公司提供;IL-5(批号20983008)ELISA试剂盒由BanderMedsystems提供。

  1.3补骨脂不同溶剂提取物补骨脂95%乙醇提取物浸膏,浓度:3.45g药材/ml(简称浸膏);补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物,浓度:10.0g药材/ml(简称石油醚萃取物);补骨脂95%乙醇提取醋酸乙酯萃取物,浓度:6.67g药材/ml(简称醋酸乙酯萃取物);补骨脂95%乙醇提取水萃取物,浓度:10.0g药材/ml(水萃取物);补骨脂水提取物,浓度:10.0g药材/ml(简称水提取物);补骨脂95%乙醇提甲醇洗脱物,浓度:2g药材/ml(简称甲醇洗脱物),以上试剂均由广州中医药大学中药学院提供。

  1.4仪器酶标仪BIO-RADSModel550,日本;CSW-Ⅰ型超声雾化器汕头光电研究所;10L玻璃干燥器。

  2方法

  2.1分组

  将动物随机分成7组,10只/组:哮喘模型组(给水,1.0ml/100g)、浸膏组(药材0.9g/100g)、石油醚萃取物组(药材2.5g/100g)、醋酸乙酯萃取物组(药材1.7g/100g)、水萃取物组(药材2.5g/100g)、水提取物组(药材10.0g/100g)、甲醇洗脱物组(药材2.5g/100g)。以上各组动物连续灌胃给药治疗10次,1次/d。末次治疗后2h,各组动物心脏采血5ml,1000r/min离心15min,血清分装(1ml/管)保存于-70℃低温冰箱内待测:IL-4,IFN-γ,IL-5(严格按照ELISA试剂盒说明书分别检测)。

  2.2卵蛋白哮喘大鼠模型的建立

  2.2.1大鼠致敏

  上述分组中每只动物腹腔注射抗原液0.5ml/100g(含卵蛋白100mg、氢氧化铝干粉100mg和2.5×109个百日咳杆菌/ml,制成悬浊液)[7]致敏第1次,次日每只大鼠再次腹腔注射0.5ml/只致敏液加强。

  2.2.2激发和治疗

  首次致敏后第15天,于每天上午8~9时大鼠置于10L玻璃干燥器内超声雾化吸入2%卵蛋白20min激发哮喘,连续14d。激发后第4天起,于每天激发后大鼠口服给相应试剂治疗(见“2.1实验分组”)。正常组以生理盐水取代抗原液按0.5ml/100g腹腔注射致敏大鼠,第2天以0.5ml/只腹腔注射生理盐水加强;首次致敏后第15天,每天上午8~9时该组大鼠超声雾化吸入生理盐水20min激发哮喘,连续14d。激发后第4天起,于每天激发后大鼠口服给蒸馏水治疗。

  2.3统计分析结果

  采用四川大学黄志勇主编的(PEMS3.0)《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包进行统计:两组均数比较t检验(方差齐)或t′(方差不齐)。

  3结果

  3.1补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠IL-5含量的影响结果见表1。由表1可见,大鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后,血清IL-5含量呈下降趋势,其中补骨脂浸膏、水萃取物、水提取和甲醇洗脱物各成分组大鼠血清IL-5含量降低明显,与哮喘模型组比较P<0.05或P<0.01,差异有显著意义。而石油醚和醋酸乙酯萃取物两成分组大鼠血清il-5含量降低不明显,与哮喘模型组比较p>0.05,无显著性差异。

  3.2补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠IL-4含量的影响结果见表1。由表1可见,大鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后,血清IL-4含量呈升高趋势,其中补骨脂浸膏、石油醚萃取物和水提取物各成分组大鼠血清IL-4含量升高明显,与哮喘模型组比较P<0.05或P<0.01,差异有显著意义。而醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脱物三成分组大鼠血清il-4含量升高不明显,与哮喘模型组比较p>0.05,无显著性差异。

  3.3补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠IFN-γ含量的影响结果见表1。由表1可见,大鼠服用补骨脂不同溶剂提取物后,不同溶剂成分大鼠血清IFN-γ含量升降不一致,其中补骨脂浸膏和石油醚萃取物两成分组大鼠血清IFN-γ含量升高明显,与哮喘模型组比较P<0.05,差异有显著意义。醋酸乙酯萃取物、水萃取物和甲醇洗脱物三成分组大鼠血清IFN-γ含量减低显著,与哮喘模型组比较P<0.05或P<0.01,有显著性差异,而补骨脂水提对ifn-γ含量未见明显影响,与哮喘模型组比较p>0.05,无显著性差异。表1不同提取物对哮喘大鼠IL-5,IL-4,IFN-γ含量的影响(略)

  3.4补骨脂不同溶剂提取物对哮喘大鼠Th1/Th2(IFN-γ/IL-5)的影响哮喘模型组、醇提浸膏组、石油醚萃取组、甲醇洗脱物组和水提取物组的Th1/Th2比值依次为(n=10):0.5±0.2,1.1±0.5,0.9±0.5,0.8±0.4和1.2±0.5。提示,大鼠服用补骨脂醇提上述4种溶剂萃取物后,血清Th1/Th2比值呈增加明显,与哮喘模型组比较P<0.05,差异有显著意义。而醋酸乙酯萃取物(0.4±0.2,n=10)和水萃取物(0.6±0.2,n=10)两成分组大鼠血清Th1/Th2降低或增加不明显,与哮喘模型组比较P>0.05,无显著性差异。

  4讨论

  哮喘与Th1细胞分泌的IFN-γ等细胞因子及Th2细胞产生的IL-4,IL-5等细胞因子含量和Th1/Th2比值密切相关。Th2的主要代表产物IL-4,能促进B细胞产生IgE,引发炎症介质释放的链式反应,促进炎症细胞的趋化聚集,引起呼吸道血管通透性增加和粘膜水肿,平滑肌痉挛及粘液分泌亢进,是引起哮喘的重要因素。Th1的主要代表产物是IFN-γ,能抑制IL-4,IL-5等细胞因子的产生,进而抑制IgE的产生和Eos活性,抑制IAR和LAR,是哮喘免疫调节中的一个重要的抑制因子,许多细胞因子通过它发挥生物效应[8]。因此,采用IFN-γ,IL-5,IL-4作为哮喘敏感指标进行药物筛选具有合理性。补骨脂是临床上常用的补肾助阳中药,具平喘之功,临床上常用于虚寒喘咳[9]。补骨脂是今后应加强研究和开发的抗气道抗炎症中药之一[2]。我院从20世纪80年代初使用补骨脂注射液治疗支气管哮喘取得了理想的疗效,但其作用的物质基础并不清楚。因此,我们在前期研究的基础上[2,3],采用卵蛋白哮喘大鼠为模型,以体内血清IFN-γ/IL-4/IL-5含量变化为指标,初步筛选补骨脂平喘作用的有效部位。

  从IFN-γ含量变化来看,补骨脂95%乙醇提取物浸膏和补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物作用明显,可能是补骨脂平喘的主要成分,但从抑制IL-5和IL-4含量分析,补骨脂95%乙醇提取水萃取物和补骨脂95%乙醇提甲醇洗脱物对Th2细胞产生的IL-4,IL-5细胞因子有较强的抑制作用,其他成分却升高或对IL-5,IL-4没有显著影响,而补骨脂水提取物对IFN-γ含量提高作用不明显。另外,补骨脂95%醇提水萃取物显著降低IL-5和IFN-γ含量,同时在给药的过程中我们发现水萃取物的毒性明显强于其他成分,这与其肾毒性是否相关值得关注。根据以上分析,我们初步推测补骨脂平喘有效部位应该主要是醇提成分:补骨脂95%乙醇提取物浸膏,补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物和甲醇洗脱物。

  从哮喘中考察Th1/Th2的比值变化更具有意义[10],因此我们以IFN-γ/IL-5为例,分析Th1/Th2的变化,探讨补骨脂3个醇提成分(浸膏、石油醚萃取物和甲醇洗脱物)哪个为平喘的最佳有效部位。哮喘模型组、醇提浸膏组、石油醚萃取物组和甲醇洗脱物组的Th1/Th2依次为(n=10):0.5±0.2,1.1±0.5,0.9±0.5和0.8±0.4,与哮喘组比较三者的P<0.05,差异有显著意义,但醇提浸膏的'比值更大。因此结合前面的分析,我们认为三者的平喘作用大小依次为:补骨脂95%乙醇提取物浸膏>补骨脂95%乙醇提甲醇洗脱物=补骨脂95%乙醇提取石油醚萃取物。

  【参考文献】

  [1]黄剑,赵陆华.补骨脂化学成分及药理研究进展[J].药学进展,2000,24(4):212.

  [2]钟南山.未来十年哮喘防治展望[J].实用医学杂志,2001,17(6):471.

  [3]谭慧淇.补骨脂注射液对支气管哮喘平喘作用的动物实验和临床观察[J].广东医学,1984,11:29.

  [4]邓时贵,李爱群,欧润妹,等.补骨脂总香豆素的平喘作用[J].中国现代应用药学杂志,2001,18(6):439.

  [5]邓时贵,区勇全,李爱群,等.补骨脂中黑色粘稠物鼻腔给药的止喘作用[J].西北药学杂志,2000,15(5):211.

  [6]邓时贵,李伟英,韩凌.总香豆素抗支气管哮喘气道变应性炎症的作用机制[J].中国新药杂志,2006,15(9):24.

  [7]童舜华,吴敦序,陈淑俊,等.小青龙汤对哮喘大鼠气道阻力、肺动态顺应性和血嗜酸细胞数的影响[J].中国中医药科技,1999,6(2):79.

  [8]BarnesPJ.Effeckofnedocromilsodiumorplatet-activatingfactorinducedairwayresponses[J].JAllergyClinImmunol,1993,92:187.

  [9]柴瑞霁.温肾助阳化痰饮,摄纳肾气平喘咳-补骨脂治疗虚寒喘咳的体会[J].山西中医,1997,13(4):49.

  [10]邓时贵,韩凌,李伟英.总香豆素对卵蛋白致敏哮喘大鼠血清Th1/Th2的影响[J].中国现代实用医学杂志,2005,4(8):1.

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