治疗脑内疾病的必要途径需将药物靶向性输送入脑内。以脑靶向性的蛋白或多肽作为载体，可能会实现药物的脑靶向转运。我们实验室以往的研究表明，狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein，RVG)的衍生肽RDP(RVG-derivedpeptide)，可携带核酸、蛋白等生物大分子入脑。脂质体是一种安全有效的药物递送方式。脂溶性化合物可被包裹在脂质体内核中，在体内安全释出以发挥作用。此外，脂质体较易修饰，从而可使其具有靶向性和高效性。本研究将在脂质体表面的PEG链端连接RDP多肽，以具有抗肿瘤效果的天然植物提取物姜黄素为模型药物，研究该RDP修饰脂质体的脑靶向作用，从而可能为向脑内送脂溶性化合物以治疗脑部疾病，提供一种崭新的途径和方法。
1 材料与方法
1.1 试剂
姜黄素，纯度>98%，购自美国Sigma公司;大豆卵磷脂、胆固醇，纯度>95%，均购自上海Aladdin公司;DSPE-PEG-NHS(PEGMW 2000)，购自美国Nanocs公司;Cys-RDP，纯度>95%，购自上海吉尔公司;乙酸乙酯、乙腈、冰醋酸均为色谱纯。
1.2 仪器
高效液相色谱仪(包含SPD-M20A检测器和LC-20AD泵)，购自日本岛津公司;激光粒度及zeta电位分析仪(NanoZS)，购自英国马尔文公司;生物质谱仪autoflexspeedMALDI-TOF/TOF，购自德国BrukerDaltonic公司;AB135-S电子分析天平，购自瑞士梅特勒-托利多公司;BF-2000氮气吹干仪，购自上海八方世纪科技有限公司;XHF-D高速分散器，购自宁波新芝生物科技有限公司。
1.3 细胞株及培养体系
人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87MG(实验室冻存)，采用含10%胎牛血清的DMEM-H培养基培养，置于37℃、5%CO2、饱和湿度下的培养箱内。隔天换液，待细胞密度长至80% ～90%时，按照1∶3的比例传代。传代时，加入消化液一定时间后去除，用培养基吹打成单个细胞悬液，取生长良好、活性大于98%的细胞进行后续实验。
1.4 实验动物
昆明小鼠80只，♂各半，体质量(20±2)g，购自于重庆滕鑫生物技术有限公司。小鼠饲养于西南大学药学院SPF小鼠饲养室，恒温、恒湿，自由进食、进水。
1.5 脂质体的制备和表征
1.5.1 导向化合物的合成
按照摩尔比2∶1的比例精密称取DSPE-PEG-NHS和RDP溶于DMF中，然后加入20μL的N-甲基吗啉，置于4mL离心管中，在搅拌器中避光搅拌48h。取出反应液，置于透析袋(MW 3500)中，放入2L去离子水中透析48h后(每6h换水1次)，冷冻干燥，-20℃保存。
1.5.2 脂质体的制备
采用薄膜分散法分别制备姜黄素脂质体(CUR-L)和RDP修饰的姜黄素隐形脂质体(RDP-CUR-L)。按照处方量(Tab1)精密称取各种脂材于10mL茄形瓶中，加入氯仿3mL溶解，37℃减压旋转蒸发10min，使其成均匀的薄膜。然后加入1mL去离子水，37℃于水浴摇床中水化1h，形成悬浮液，间歇超声90s，得到澄清透明呈淡黄色乳光的脂质体溶液，并分别过100nm的膜使粒径分布均匀，4℃冰箱内保存。
1.5.3 DSPE-PEG-RDP比例筛选
按上述脂质体制备方法制备一系列含不同比例DSPE-PEG-RDP的含药靶向脂质体(DSPE-PEG-RDP分别为总摩尔量的0.5%、1.0%、2.0%和5.0%)。采用MTT法考察不同密度下的RDP-CUR-L对U87MG细胞抑制率的影响。取对数生长期状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化液消化后，调整细胞浓度为5×107·L-1，以每孔500μL(5000个/孔)接种于96孔板，培养24h贴壁后加入不同浓度的CUR-L和RDP-CUR-L，浓度依次为150、75、37.5、18.8、9.4、4.7μmol·L-1，孵育48h后，弃去培养基，每孔加入浓度为5g·L-1的MTT(20μL)，37℃培养4h，弃去培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝紫色甲#颗粒，用酶标仪在波长为490nm下测定光吸收值(OD)。每组实验重复3次，每个样品做3个平行样。全部实验均设DMSO对照组。计算药物抑制率和对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)。药物抑制率/% =(1-OD实验组-OD空白组/OD对照组-OD对照组)×100%1.5.4 脂质体粒径、电位、分散度测定 用激光粒度及zeta电位分析仪分别测定CUR-L和RDP-CUR-L的粒径、Zeta电位、分散度(PDI)。
1.5.5 脂质体包封率测定
采用透析破乳法，取用均质机处理过的CUR-L和RDP-CUR-L，每组实验分成两份(每份400μL)：一份用透析液透析6h后，收集脂质体部分，以10%的TritonX-100破乳，经HPLC测定包裹在脂质体内的药物浓度C;另一份直接破乳，经HPLC测定姜黄素得到C0，按照公式计算出包封率(包封率=C/C0×100%)。
1.5.6 脂质体稳定性考察
取制得的CUR-L和RDP-CUR-L，分成两个实验组，每组平行3次，分别于3、7、15、30、45、60d后肉眼观察脂质体溶液变化，HPLC测包封率。
1.5.7 体外释放度测定
采用动态透析法(dynam-icdialysis)，按中国药典2010版附录XC第三法(小杯法)测定释放度。精密量取制剂CUR-L、RDP-CUR-L各0.5mL，经释放介质稀释至3mL，装于透析袋内(截留分子质量为8000u)，两端扎牢，放入150mL释放介质中，释放介质为含有0.2%十二烷基硫酸钠的人工胃液，37℃ 下姜黄素在此释放介质中的溶解度为80mg·L-1，满足漏槽条件。37℃恒温水浴搅拌(转速为100r· min-1)。分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24h各个时间点取样0.3mL，并及时补充等温的相同体积空白介质。微孔滤膜过滤，按照HPLC方法检测姜黄素含量，并计算累积释药百分率(%)。
1.6 姜黄素悬浮液和脂质体的体内分布
1.6.1 色谱条件
C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，大连依利特分析仪器公司);流动相：乙腈∶4%冰醋酸(48∶52)，流速：1mL·min-1，检测波长：430nm，柱温：25℃。
1.6.2 样品预处理
将姜黄素溶解于1%羧甲基纤维素钠中，配制成浓度为1g·L-1的CUR混悬液，制得的CUR-L和RDP-CUR-L浓度均为1g·L-1，CUR、CUR-L、RDP-CUR-L均按照姜黄素30mg·kg-1的剂量于小鼠尾静脉注射给药。取昆明小鼠，禁食12h，尾静脉分别注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L，于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12h各个时间点分别取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑(每个时间点3只)，用生理盐水清洗后用滤纸吸干，剪碎，精密称重，加入1mL生理盐水，用组织匀浆器匀浆，加入1mL乙酸乙酯，涡旋3min，3000r·min-1离心10min，精密吸取上清液，再加入相同体积的乙酸乙酯，萃取2次，合并上清液，氮气吹干，加入10倍体积的流动相，超声、涡旋使其充分溶解，过膜后进样。
1.6.3 方法学考察
专属性：取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑各空白组织匀浆液0.3mL，样品处理后采用HPLC法分别进样测定空白样品、空白样品加内标及小鼠尾静脉注射给药后的样品。标准曲线：取小鼠空白组织匀浆液，精密加入姜黄素标准溶液，配制成1.6、3.1、6.2、12.5、25、50mg·L-1系列浓度的样品溶液，样品处理后，以姜黄素的峰面积与样品中姜黄素的浓度(C)进行线性回归。回收率与精密度：配制低、中、高浓度(3、12.5、50mg·L-1)的姜黄素质控样品，各5份，按“样品处理”项下方法处理，进样测定。以姜黄素的峰面积代入标准曲线方程，计算出姜黄素的浓度，与实际加入量比较，计算方法回收率，用以表示准确度;以相应低、中、高浓度的姜黄素对照品溶液直接进样，以质控样品中姜黄素峰面积与对照品溶液中姜黄素峰面积比较，计算提取回收率;1d内进样测定5次，连续测定5d，计算日内RSD和日间RSD。
2 结果
2.1 脂质体的制备和表征
2.1.1 导向化合物的合成 生物质谱分析反应产物DSPE-PEG-RDP的结果如Fig1所示。RDP相对分子质量为3671，DSPE-PEG-NHS分子质量为3094，得到的产物DSPE-PEG-RDP相对分子质量约为6800，说明导向化合物制备成功。
2.1.2 脂质体的粒径、zeta电位、分散度及包封率 CUR-L和RDP-CUR-L粒径、zeta电位、分散度和包封率如Tab2所示。结果表明，CUR-L粒径为(81.20±5.13)nm，而RDP-CUR-L经RDP修饰过后粒径为(98.56±6.97)nm，分散性良好，包封率均大于85%，制备重现性较好。
2.1.3 脂质体稳定性 CUR-L和RDP-CUR-L4℃冰箱放置60d后，溶液依旧澄清透明，呈淡黄色乳光，与新制备时相比无明显变化。不同时间点测其包封率，可以看出RDP修饰对姜黄素脂质体包封率影响不大，60d后CUR-L和RDP-CUR-L的包封率仍然在80%左右，可见稳定性良好。
2.1.4 导向化合物DSPE-PEG-RDP比例筛选 结果如Fig3所示，当加入的DSPE-PEG-RDP为总摩尔量的1.0%时，RDP-CUR-L对U87细胞的抑制作用明显优于CUR-L(P<0.01)。随着DSPE-PEG-RDP比例的增加，U87细胞的存活率逐渐降低，这表明在脂质体的PEG链端连接RDP能增强对U87细胞的抑制作用，当加入比例达5.0% 时，RDP-CUR-L对U87细胞的抑制作用最强，与0.5%时相比差异有显著性(P<0.05)。当比例超过1%时，RDP-CUR-L对U87细胞的抑制变化不明显，表明继续增加DSPE-PEG-RDP的量并不能提高RDP-CUR-L对U87细胞的`抑制率。密度筛选实验结果表明，DSPE-PEG-RDP的加入比例能影响脂质体的靶向效率。出于实验效果和经济性考虑，选取加入比例为1.0%进行以下的实验
。2.1.5 体外药物释放 由于姜黄素在水中几乎不溶解，采用加入2% 十二烷基硫酸钠(SDS)的人工胃液为释放介质，考察姜黄素制剂的释药情况。结果如Fig4所示，CUR-L在前6h内大量释放，累计释放量接近60%，而后进入慢速释放期，12h释放量约为80%，而RDP-CUR-L释放在该释放介质中较慢，6h后释放约45%，24h后累积释放量不到80%，表明RDP-CUR-L有着更好的缓释作用。
2.2 姜黄素悬浮液和脂质体的体内分布
2.2.1 方法学考察
在上述色谱条件下，方法专属性良好，峰形良好，保留时间约为14min，组织中的内源性物质不干扰样品测定，见Fig5。样品中的姜黄素在1.5625～50mg·L-1线性关系良好(r=0.9994)。方法回收率为(95.87±4.98)%，高、中、低3个浓度的提取回收率分别为(94.79±1.94)%、(95.26±2.87)% 和(95.18±1.78)% (n=5)，日内精密度和日间精密度小于15%，均符合生物样品分析方法的要求。
2.2.2 体内分布和脑靶向作用考察
小鼠尾静脉注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L后不同时间各组织中的姜黄素分布见Fig6。注射CUR后，随着时间的推移，姜黄素在各个脏器中含量逐渐减少，姜黄素大量分布在肺、肝、肾等脏器中，心、脾中也有少量分布，然而由于血脑屏障的作用，脑部并未检测到姜黄素。注射CUR-L后，由于易被网状内皮系统吞噬，姜黄素主要分布在肝、肾、肺中，在脑、脾中少量分布，而在心脏中没有检测到姜黄素。RDP-CUR-L经尾静脉给药后大致分布与CUR-L类似，但在脑中检测到大量的姜黄素，并且在小鼠体内的滞留时间明显延长，24h仍然能在脑中检测到姜黄素。
3 讨论
脂质体作为药物载体具有使药物被动靶向网状内皮系统、延长药物作用时间、减少药物不良反应、提高疗效等优点。表面经柔性高分子PEG修饰，增大了脂质体的空间位阻，同时提高了膜表面亲水性，使得其不易被网状内皮系统(reticularepithelialsystem，RES)摄取，因而PEG化的脂质体较普通脂质体更长效。虽然脂质体经PEG修饰后能够延长在体内的循环时间，增加在肿瘤组织中的聚集，但是由于“PEGdilemma”现象的存在，阻碍了肿瘤细胞对脂质体的内吞，故在脂质体的PEG链端连接靶向配体如叶酸、转铁蛋白、抗-EGFR抗体等，使得靶向配体与肿瘤细胞过度表达的受体特异性结合，通过“配体-受体”特异性识别与结合作用，能够促进细胞对载体的$吞，增加药物的抗肿瘤效果，并且可以定向地将药物运送到靶部位，实现对肿瘤组织的“主动靶向”。脂质体或者纳米粒子表面修饰特异性配体或受体，主动靶向特定肿瘤组织的文献已有大量报道。一些常见的细胞穿膜肽，如TAT、多聚Arg、转运素，已被证实能够在体外将核酸、蛋白等小分子物质转导入培养的细胞。Khafagy等研究发现，L-型穿膜肽penetratin可以明显增加胰岛素的渗透性，从而使其穿过鼻膜，并不会对鼻吸收黏膜上的细胞完整性造成明显的破坏。据文献报道，另一个从狂犬病毒糖蛋白衍生出的一个小肽与多聚Arg连接后，能够输送siRNA靶向性地进入中枢神经系统，导致相关基因沉默。KaiPharmaceutical公司应用Tat引导蛋白激酶C抑制剂的蛋白调节子，用于脑缺血和急性心肌缺血的治疗，并且已于2007年进入了Ⅱ期临床试验。然而，用细胞穿膜肽引导脂质体等纳米载体进入特定的组织，特别是脑组织的文献却并不多见。普通CPPs虽然能介导各类分子入胞，但是其缺乏细胞特异性，而本实验中所用的细胞穿膜肽RDP是一种来源于狂犬病毒糖蛋白RVG，并经过结构改造而得到的一种能靶向中枢神经系统、具有很强嗜神经性的衍生肽，同时具有良好的穿膜特性和对神经细胞的高度选择性。
实验室前期研究已表明RDP能够引导核酸、多肽等小分子物质入脑，而本实验中通过体内分布实验证明了RDP连接的姜黄素脂质体在体内运输过程中没有发生断裂，确实能够携带包裹了姜黄素的脂质体入脑，不仅仅拥有理论意义，也具有潜在的应用价值。这为脑部疾病的治疗提供了新的思路。
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